Characterization of cationic conductance in Red Blood Cells; insights from pharmacological and pathophysiological studies
Caractérisation de la conductance cationique dans les globules rouges ; apports des études pharmacologiques et physiopathologiques
Résumé
Over their lifespan, erythrocytes circulate throughout the body to carry respiratory gases and perform their other functions. Therefore, erythrocytes must deform properly to circulate in all vessels, including the smallest of the capillaries. This ability is governed by a complex membrane-cytoskeleton network combined with a finely tuned surface-volume ratio that allows instantaneous shape changes to enable rapid RBC transit. This highlights how important it is to maintain cell volume to ensure a 120-day journey without the possibility of repair. Cell volume or hydration status is directly influenced by the activity of membrane transporters, pumps, and ion channels. The permeability of erythrocytes, which is dominated by anion movement for physiological reasons, implies that cation movement should be kept as low as possible to avoid any change in cell volume. However, in many pathophysiological conditions, cation permeabilities are known to be deregulated, leading to increased intracellular Ca2+ and Na+ levels. My thesis aimed to better characterize the role of non-selective cation (NSC) channels (PIEZO1, TRPV2), and Gárdos channel in such pathophysiological conditions. Experiments were carried out on healthy erythrocytes as well as on cells from patients suffering from different pathologies like Sickle Cell Disease (SCD), xerocytosis, and stomatocytosis, using electrophysiological methods (MBE and patch-clamp), Ca2+ movements semi-quantification (flow cytometry and live-cell imaging) combined with the measurement of morphometric parameters, and the measurements of intracellular cell volume and other ions contents. In two independent studies using blood from sickle cell patients, we were able to demonstrate from one part the central role of PIEZO1 activation in the enhancement of sickling propensity. In the other part, we demonstrated the increased sensitivity of sickle cells to THC stimulation via TRPV2 activation. Along with these published results, we have contributed to the functional characterization of many PIEZO1 and KCNN4 variants, for which we have designed a series of functional experiments to better describe the genetically identified variants. This part with 5 Gárdos and 10 PIEZO1 variants increases the knowledge about the pathogenicity of the identified mutations, often characterized as variants of uncertain significance (VUS). We were also able to demonstrate that Dooku1, a chemical compound described in the literature as an inhibitor of Yoda1's effects, is in fact, a direct activator of PIEZO1 in erythrocytes, contributing to a more accurate pharmacology of PIEZO1. Furthermore, we conducted a series of experiments in patients treated with Alectinib (a lung cancer treatment), for which frequent anemia associated with cell volume dehydration is observed. Taken together, these studies contribute to the understanding of cation permeabilities under physiological and pathophysiological conditions. Finally, all these results highlight the particularity of RBCs regarding cationic permeability and biophysical membrane properties compared to other cell types and, more importantly when mechanosensitive pathways are involved in such ion movements.
Au cours de leur vie, les érythrocytes circulent dans tout le corps pour transporter les gaz respiratoires et remplir leurs autres fonctions. Par conséquent, les érythrocytes doivent être capable de se déformer correctement pour circuler dans tous les vaisseaux, y compris les plus petits capillaires. Cette capacité est régie par un réseau complexe associant les protéines de la membrane et du cytosquelette combiné à un rapport surface-volume finement ajusté, permettant ainsi des changements de forme instantanés pour permettre un transit rapide des GR. Cela montre à quel point il est important de maintenir le volume cellulaire pour assurer 120 jours dans la circulation. Le volume cellulaire ou l'état d'hydratation est directement influencé par l'activité des transporteurs membranaires, des pompes et des canaux ioniques. La perméabilité des érythrocytes, dominée par le mouvement des anions pour des raisons physiologiques, implique que le mouvement des cations doit être maintenu aussi bas que possible pour éviter toute modification du volume cellulaire. Cependant, dans de nombreuses conditions physiopathologiques, la perméabilité aux cations est connue pour être dérégulée, conduisant à une augmentation des niveaux intracellulaires de Ca2+ et de Na+. L'objectif de ma thèse était de mieux caractériser le rôle des canaux cationiques non sélectifs (PIEZO1, TRPV2) et du canal Gárdos dans ces conditions physiopathologiques. Des expériences ont été réalisées sur des érythrocytes issus de donneurs sains ou de patients souffrant de différentes pathologies telles que la drépanocytose, la xérocytose et la stomatocytose, en utilisant des méthodes électrophysiologiques (MBE et patch-clamp), des mesures semi-quantitatives des mouvements de Ca2+ (cytométrie en flux et imagerie cellulaire) combinées à la mesure de paramètres morphométriques, ainsi que des mesures du volume cellulaire et des contenus en ions. Dans deux études indépendantes utilisant du sang de patients drépanocytaires, nous avons pu démontrer d'une part le rôle central de l'activation de PIEZO1 dans l'augmentation de la propension à la falciformation. D'autre part, nous avons démontré une sensibilité augmentée des GR drépanocytaires à la stimulation par le THC via l'activation du TRPV2. Parallèlement à ces résultats publiés, nous avons contribué à la caractérisation fonctionnelle de nombreux variants de PIEZO1 et de KCNN4, pour lesquels nous avons conçu une série d'expériences fonctionnelles afin de mieux décrire les variants génétiquement identifiés. Cette partie avec 5 variants Gárdos et 10 variants PIEZO1 apporte des éléments fonctionnels quant à la pathogénicité des mutations identifiées et souvent classées comme des variants de signification incertaine (VUS) par les algorithmes génétiques. Nous avons également pu démontrer que la molécule Dooku1, décrite dans la littérature comme un inhibiteur des effets de Yoda1, est en fait un activateur direct de PIEZO1 dans le globule rouge, contribuant à une pharmacologie plus précise de PIEZO1. En outre, nous avons mené une série d'expériences chez des patients traités à l'Alectinib (un traitement contre le cancer du poumon), pour lesquels on observe une anémie fréquente associée à une déshydratation cellulaire. L'ensemble de ces expériences a contribué à la compréhension des perméabilités aux cations dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Enfin, tous ces résultats remettent en évidence la particularité des GR en ce qui concerne la perméabilité cationique et les propriétés biophysiques des membranes par rapport à d'autres types de cellules et, plus important encore, lorsque des voies mécanosensibles sont impliquées dans de tels mouvements d'ions.
Origine : Version validée par le jury (STAR)